GFP-CERTIFIED® Кит за откриване на Апоптоза/Некроза, 100 анализа

Преходът от апоптоза към некроза е слабо дефиниран, което налага разпознаване на различните етапи на процеса. Появата на фосфатидилсерин (PS) върху извънклетъчната повърхност на плазмената мембрана остава обединяващ отличителен белег на ранната апоптоза. Фосфолипид-свързващите протеини като Анексин V се свързват с висок афинитет към PS в присъствието на Ca2+. Като се има предвид, че Анексин V не преминава през клетъчната мембрана, свързването на външния PS е селективно за ранните апоптотични клетки. По същия начин, загубата на целостта на плазмената мембрана, което се демонстрира от способността на мембранно-непермеабилно ДНК интеркалиращо багрило да маркира ядрото, представлява директен подход за демонстриране на апоптоза и некроза в късен стадий. Като се има предвид, че Анексин V обикновено се конюгира с флуоресцеин (известен още като FITC), откриването на апоптоза в клетки, експресиращи зелен флуоресцентен протеин (GFP), може да бъде проблематично. Спектралното припокриване между емисионните профили на тези два флуорофора прави диференцирането на сигналите трудно или невъзможно, като по този начин компрометира качеството на данните като цяло. Въпреки че е полезна за анализ на апоптоза и некроза в клетки, които не експресират никакви флуоресцентни протеини, системата за откриване на апоптоза/некроза GFP-CERTIFIED® е специално проектирана за използване с GFP-експресиращи клетъчни линии и клетки, експресиращи сини или циан флуоресцентни протеини (BFP, CFP). В допълнение, комплектът е подходящ за използване с живи или фиксирани клетки белязани със сонди, като маркирани антитела или други флуоресцентни конюгати, показващи подобни спектрални свойства като флуоресцеин или кумарин. Този комплект включва всички необходими реагенти за определяне на ранни и късни стадии на апоптоза, както и некроза. Конюгат Annexin V-EnzoGold (подсилен Cyanine-3) позволява откриване на апоптоза, различна от флуоресцеин или GFP. Реагентът за откриване на некроза (червен), подобен на излъчващото червено багрило 7-AAD, улеснява откриването на късна апоптоза и некроза. Този комплект включва също индуктор на апоптоза (ставроспорин) за използване като положителна контрола. Реагентите за откриване могат да се използват отделно или в комбинация съответно за единични или мултиплексирани приложения. Този комплект също осигурява бързи и точни резултати чрез поточна цитометрия и флуоресцентна/конфокална микроскопия.

ФЛОУ ЦИТОМЕТРИЯ. Клетките на Jurkat  саиндуцирани с 0,2% DMSO (панел А) или индуцирани с 2uM ставроспорин (панел В) в продължение на 4 часа. при 37°C. След третиране, клетките се инкубират с буфер, съдържащ Анексин V-цианин 3 и реагент за откриване на некроза (червен), ДНК-интеркалиращо багрило, излъчващо в далечната червена зона; след което се анализират чрез поточна цитометрия с помощта на 488nm лазер с флуоресцентно откриване с FL2 (реагент за откриване на апоптоза) и FL3 (реагент за откриване на некроза) канали. Мнимо-индуцираните клетки са предимно отрицателни за апоптоза и некроза. След 4-часово третиране има три популации от клетки: (1) клетки, които са жизнеспособни и не са апоптотични или некротични (анексин V-цианин 3 и реагент за откриване на некроза са отрицателни); (2) клетки, подложени на апоптоза (Анексин V-цианин 3 положителен и NDR отрицателен); и (3) клетки, подложени за апоптоза в късен стадий и ранна некроза (анексин V-цианин 3 и положителен реагент за откриване на некроза).

Спецификация